其实从严格的词学意义上来说，细胞程序性死亡（PCD）与细胞凋亡是有很大区别的。细胞程序性死亡，是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。而细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。

细胞凋亡形态变化：细胞膜、细胞器相对完整，细胞核固缩

从左至右依次是细胞核核缩、核溶、核碎

接下来我们了解一下细胞凋亡的检——测——方——法：

按分类，细胞凋亡的检测方法有形态学检测、细胞功能检测，以及生化标记检测法。那么这些方法又有哪些优缺点呢？

1、形态学检测方法：

1）细胞器亚显微结构观察，电镜：

优点：凋亡检测金标准。

缺点：无法定量；实验步骤繁琐。

2）细胞核染色、镜检（Hoechst 33342）

优点：成本低、操作方便、可定量。

缺点：需对细胞进行计数。

2、细胞功能检测方法：

1）线粒体膜电位检测 JC-1，MitoTracker

优点：适合成像检测，染色结果只能用来判断线。

缺点：粒体膜电位是否丢失，不能定量。

2）细胞膜表面磷脂酰丝氨酸检测 Annexin V-AbFluor 488/PI

优点：受欢迎的细胞凋亡检测方法。

缺点：需制备单细胞悬液，可对凋亡不同时期比例进行定量。

3、生化标记检测法

1）凋亡分子标记检测 Caspase的活性检测 Caspase含量检测（WB）

优点：能够进行高通量筛选、可定量。

2）DNA损伤检测 DNA电泳 TUNEL法

优点：适合用于组织切片样本的凋亡研究。

缺点：电泳检测耗时，无法定量，稳定性差。

精准细胞凋亡检测的组合检测方法

一、Annexin V-AbFluor 488/PI检测方法

将Annexin V-AbFluor 488（绿色荧光）与PI（红色荧光）配合使用，可以准确的区分开凋亡早期、凋亡晚期及死细胞。

对于这种方法样本处理、染色操作及荧光的拍照决定了凋亡检测的精准度，对于不用样本及不同的检测方法，建议按照如下宝贵经验进行：

1、荧光拍照关键

1）悬浮细胞或重悬液制片拍照

将细胞用少量PBS或重悬液将细胞重悬成细胞浓缩液，吸取5-10ul在洁净的防脱载玻片上进行画圈涂片，盖上盖玻片立刻在显微镜下立即进行镜检。处理过程中注意速度，防止细胞死掉，重悬密度不易过小，进行涂片时以小于10ul的细胞悬液体积zui适，整个操作建议在10min内完成。

2）细胞培养小皿或爬片拍照

皿底留有少量缓冲液，避免干片。拍照前一定先轻柔清洗，防止因清洗不充分导致拍照过程中有非特异性背景。

用喜树碱诱导Hela细胞24小时，用Annexin V-AbFluor 488凋亡检测试剂盒（KTA0002）进行染色。能被Annexin V- AbFluor 488/PI染色(绿色膜和红色碎片核)是早期凋亡细胞、坏死或晚期凋亡细胞。

2、流式实验关键步骤

1）消化细胞时避免假阳性

为防止假阳性的产生，消化细胞建议使用无EDTA的胰酶。

2）设置对照组

在流式细胞术中所测得的量是相对值，而非值。如需知道值则必

设置对照组，对照组包括有阴性对照和阳性对照。上机检测时建议设置空白组，Annexin V-AbFluor 488/PI单染组对照组，另需要提前调试好流式细胞仪。

3）检测的细胞量要适中

建议准备足量细胞，一般建议1×106 个细胞，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果不准确，如细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也受影响。

喜树碱诱导Hela细胞24小时，用Annexin V- AbFluor 488凋亡检测试剂盒（KTA0002，Abbkine）进行检测。使用Annexin V-AbFluor 488和碘化丙啶PI可以区分早期凋亡细胞(Annexin V- AbFluor 488阳性)、晚期凋亡或坏死细胞(Annexin V- AbFluor 488和碘化丙啶阳性)。

二、TUNEL检测方法

1、组织TUNEL实验中关键步骤

1）充分脱蜡和水化 <TIPS>

脱蜡前切片可以先在65℃烤箱中烘烤30min，再使用二甲苯进行脱蜡10-20min，而水化则用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗5min。

2）把握好细胞通透的时间 <TIPS>

根据切片的厚薄选择蛋白酶k的孵育时间，蛋白酶K使用浓度不得低于

20 μg/mL，常用37℃处理10-30 min，6um切片时间稍短，20um切片增长时间，通过摸索达到既不脱片又能够使后面的酶和抗体进入胞内。处理时间过长易脱片、过短达不到通透效果。

3）适当延长TUNEL反应液时间 <TIPS>

建议处理条件是37℃反应2 h，可以根据预估的凋亡损伤程度选择更长的时间，建议结合zui终的背景着色进行判断。

4）PBS的充分清洗 <TIPS>

在TUNEL反应后的清洗应十分严格，建议使用PBST重复清洗后再换PBS彻底清洗，或者增加PBS洗涤次数，因为这些清洗直接决定zui后切片的非特异性着色。

小鼠肠道组织石蜡切片，200倍放大，红色荧光为发生晚期凋亡的细胞。

使用试剂：KTA2011 TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒 (橙色荧光)、DAPI

操作步骤流程图：

2、细胞TUNEL实验中关键步骤

1）加药模型的判断处理 <TIPS>

细胞样本做TUNEL时一定需要确认模型是否成功，在白光的镜检时需能明显判断凋亡的细胞。

2）蛋白酶k的使用<TIPS>

蛋白酶K目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。浓度过高或孵育时间太长非常容易使细胞脱落，建议使用20 μg/mL的蛋白酶K（0.5% Triton X-100），反应时间建议为5-15 min。

注意：关键试剂蛋白酶K一定需要摸索出zui适合的使用条件。如温度过高，反应时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。